Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Izolacja DNA fagowego

4.3 Izolacja DNA fagowego

 Do 1 ml zawiesiny cząstek dodawano RNazę i DNazę do uzyskania końcowych stężeń 10 µg/ml. Mieszaniny inkubowano przez godzinę w temperaturze 37 °C. Dodawano roztwór EDTA do końcowego stężenia 20 mM i inkubowano w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Do roztworów dodawano proteinazę K do końcowego stężenia 100 µg/ml oraz SDS do końcowego stężenia 0,5%. Próbki mieszano poprzez odwracanie, po czym inkubowano w temperaturze 56 °C przez 1,5 godziny. Następnie przeprowadzono ekstrakcję białek mieszaniną fenol/chloroform w objętościach identycznych z objętościami próbek, energicznie mieszano poprzez odwracanie aż do utworzenia się homogennej emulsji. Wirowano z prędkością 3000 g przez 6 min w celu rozdzielenia fazy wodnej i fazy organicznej. Zbierano fazę wodną i procedurę powtarzano aż do zaniku interfazy. Próbki oczyszczono z resztek fenolu poprzez ekstrakcję chloroformem, wirowano z prędkością 3000 g przez 6 min w celu rozdzielenia fazy wodnej i fazy organicznej. Do każdej z próbek dodawano izopropanol w proporcji objętościowej 1:1. Próbki mieszano i inkubowano w temperaturze -20 °C przez noc. Próbki wirowano przy prędkości 13,2 tys. rpm przez 3 min w 4 °C. Supernatant usuwano pipetą, a osad płukano 70%-owym etanolem, próbki wirowano przez 5 min przy prędkości 13,2 tys. rpm w temperaturze 4 °C. Osad suszono z resztek etanolu przez około 15-30 minut w temperaturze pokojowej, DNA zawieszono w 40 µl wody destylowanej. Pomiar stężeń DNA wykonano z użyciem aparatu Nano-Drop zgodnie z instrukcją podaną przez producenta.