Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Reakcja PCR

Wykonywano pomiar stężenia matrycy dla badanej próbki. W oparciu o pomiar wyliczano potrzebną ilość matrycy, którą następnie dodawano do mieszaniny reakcyjnej (objętość matrycy dostarczająca plazmidowy albo wirusowy DNA do mieszaniny reakcyjnej w ilości od 1 pg do 10 ng). Reakcję przeprowadzano według programu termocyklera (Tabela 6).

Tabela 6. Warunki reakcji PCR przeprowadzanych w niniejszej pracy.
Etap Temperatura Czas
Denaturacja wstępna 98 °C 30 sek
35 cyklów Denaturacja 98 °C 10 sek
Hybrydyzacja startera 64 °C 30 sek
Elongacja 72 °C 30 sek
Elongacja uzupełniająca 72 °C 3 min
Zatrzymanie 4 °C

Buforem stosowanym do reakcji PCR był bufor HF (ang. High Fidelity) (Podrozdział 3.6). Enzymem stosowanym do reakcji PCR była polimeraza DNA Phusion (Podrozdział 3.6). Skład mieszaniny oraz kolejność dodawania komponentów przedstawia Tabela 7:


Tabela 7. Składniki reakcji PCR przeprowadzanych w niniejszej pracy.
kolejność Składnik Objętość Końcowe stężenie
1 woda destylowana dopełniająco do 50 µl
2 5X bufor Phusion HF 10 µl 1X
3 10 mM dNTP-y 1 µl 200 µM
4 10 µM starter Forward 2,5 µl 0,5 µM
5 10 µM starter Reverse 2,5 µl 0,5 µM
6 matryca DNA zmiennie 1 pg – 10 ng
7 polimeraza DNA Phusion 0,5 µl 1U

Polimerazę DNA dodawano tuż przed umieszczeniem próbek w termocyklerze. Po zakończeniu programu wykonywano kontrolę poprzez nałożenie na żel agarozowy około 10 µl produktu PCR wraz z miarką molekularną i wykonywanie elektroforezy – obecność prążka na przewidywanej wysokości świadczyła o udanym wykonaniu procedury.


Tekst udostępniony jest na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Na tych samych warunkach 3.0.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.