Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Reakcja PCR
Wykonywano pomiar stężenia matrycy dla badanej próbki. W oparciu o pomiar wyliczano potrzebną ilość matrycy, którą następnie dodawano do mieszaniny reakcyjnej (objętość matrycy dostarczająca plazmidowy albo wirusowy DNA do mieszaniny reakcyjnej w ilości od 1 pg do 10 ng). Reakcję przeprowadzano według programu termocyklera (Tabela 6).
Etap | Temperatura | Czas | |
Denaturacja wstępna | 98 °C | 30 sek | |
35 cyklów | Denaturacja | 98 °C | 10 sek |
Hybrydyzacja startera | 64 °C | 30 sek | |
Elongacja | 72 °C | 30 sek | |
Elongacja uzupełniająca | 72 °C | 3 min | |
Zatrzymanie | 4 °C | ∞ |
Buforem stosowanym do reakcji PCR był bufor HF (ang. High Fidelity) (Podrozdział 3.6). Enzymem stosowanym do reakcji PCR była polimeraza DNA Phusion (Podrozdział 3.6). Skład mieszaniny oraz kolejność dodawania komponentów przedstawia Tabela 7:
kolejność | Składnik | Objętość | Końcowe stężenie |
1 | woda destylowana | dopełniająco do 50 µl | |
2 | 5X bufor Phusion HF | 10 µl | 1X |
3 | 10 mM dNTP-y | 1 µl | 200 µM |
4 | 10 µM starter Forward | 2,5 µl | 0,5 µM |
5 | 10 µM starter Reverse | 2,5 µl | 0,5 µM |
6 | matryca DNA | zmiennie | 1 pg – 10 ng |
7 | polimeraza DNA Phusion | 0,5 µl | 1U |
Polimerazę DNA dodawano tuż przed umieszczeniem próbek w termocyklerze. Po zakończeniu programu wykonywano kontrolę poprzez nałożenie na żel agarozowy około 10 µl produktu PCR wraz z miarką molekularną i wykonywanie elektroforezy – obecność prążka na przewidywanej wysokości świadczyła o udanym wykonaniu procedury.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.