Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Wyniki i dyskusja/Analiza bioinformatyczna
Identyfikacja ORFów w genomie bakteriofaga φOS10 została przeprowadzona z użyciem programu RAST [Decewicz & Radlińska, dane nieopublikowane], a ich adnotację wykonywano w ramach niniejszej pracy programami: Artemis, BLAST P oraz HMMER (Podrozdział 4.17.2).
Genom φOS10 miał długość 45 027 nt – wielkość ta jest typowa dla przedstawicieli rzędu Caudovirales, jednak wśród innych dotychczas zsekwencjonowanych bakteriofagów infekujących bakterie z rodzaju Serratia jest to długość stosunkowo niewielka: genomy zsekwencjonowanych bakteriofagów Serratia osiągają długości od 39 216 bp (bakteriofag 2050H2, Gene Bank MF285620.1) do 357 154 bp (bakteriofag BF, Gene Bank NC_041917.1), gdzie średnia długość genomu wynosiła 139 444 bp, a mediana 158 616 bp. Zestawienie wszystkich genomów bakteriofagów przedstawiono w Podrozdziale 1.7. Udział poszczególnych zasad azotowych w nici wiodącej zsekwencjonowanego genomu φOS10 przedstawiono w Tabeli 9.
| Zasada | Zawartość [%] | Ilość [nt] |
| A | 23,87% | 10750 |
| T | 24,52% | 11040 |
| G | 24,58% | 11068 |
| C | 27,03% | 12169 |
| % GC | 51,61% | |
Zawartość par GC jest mniejsza niż w przypadku genomów bakterii z rodzaju Serratia, które do tej pory zsekwencjonowano np. w szczepie Serratia marcescens subsp. marcescens Db11 wynosi 59,5% [Iguchi i in., 2014]; w szczepie Serratia liquefaciens ATCC 27592 wynosi 55,3% [Nicholson i in., 2013]; zaś w szczepie Serratia proteamaculans 568 wynosi 54,9% [Grkovic i in., 1995]. Sekwencję genomu φOS10 przyrównano z użyciem narzędzia BLAST N do sekwencji genomów innych bakteriofagów infekujących Serratia. Wykryto podobieństwo sekwencji nukleotydowej bakteriofaga φOS10 jedynie do dwóch spośród 20 poznanych i zsekwencjonowanych wcześniej fagów Serratia (Rycina 18):
- do bakteriofaga Parlo (Gene Bank MK618715.1) w dwóch segmentach (o długości 381 nt, gdzie e = 2 * 10 - 133; oraz o długości 42 nt, gdzie e = 1 * 10 - 12), co stanowi w sumie 0,67% długości genomu bakteriofaga Parlo;
- do bakteriofaga η (Gene Bank NC_021563.1) w czterech segmentach (o długości 96 nt, gdzie e = 2 * 10 - 33; o długości 98 nt, gdzie e = 2 * 10 - 27; o długości 35 nt, gdzie e = 3 * 10 - 11 i o długości 32 nt, gdzie e = 1 * 10 - 9), co stanowi w sumie 0,61% długości genomu bakteriofaga η.
|
> Eta_1 NC_021563.1 (13351-13446) |
Sekwencje przedstawione na Rycinie 18 zbadano z użyciem narzędzia BLAST X, w wyniku czego udało się zadnotować jedynie sekwencje:
- Parlo_1, którą dopasowano do hipotetycznego białka bakteriofaga Parlo (e = 2 * 10 - 77) (Gene Bank QBQ72186.1);
- Eta_1, którą dopasowano do hipotetycznego białka S. marcescens (e = 8 * 10 - 11) (Gene Bank TQI84827.1);
- Eta_2, którą dopasowano do białka „restriction alleviation protein” z rodziny białek Lar, należącego do S. marcescens (e = 1 * 10 - 8) (Gene Bank WP_080431124.1). Białko to odpowiedzialne jest za modulację systemów restrykcji i modyfikacji [King & Murray, 1995].
We względu na niskie wartości pokrycia (0,67% dla bakteriofaga Parlo i 0,61% dla bakteriofaga η) nie można uznać tych bakteriofagów za spokrewnione z bakteriofagiem φOS10 – podobieństwo tych sekwencji jest najprawdopodobniej przypadkowe lub spowodowane nabyciem ich na drodze zdarzeń rekombinacyjnych. Powyższe wyniki wykluczają jakiekolwiek istotne podobieństwo genomu bakteriofaga φOS10 do innych dotychczasowo zsekwencjonowanych bakteriofagów Serratia oraz jakichkolwiek innych zsekwencjonowanych bakteriofagów, w związku z czym jest on unikatowy i stanowi ważny wkład w wiedzę o bakteriofagach Serratia. Genom φOS10 przeanalizowano z użyciem programu ARAGORN [Laslett i in., 2004] pod kątem obecności genów kodujących tRNA (Podrozdział 4.17.5), nie znaleziono w genomie sekwencji kodujących tRNA.
W genomie φOS10 zidentyfikowano 71 otwartych ramek odczytu (ORF) o wielkości co najmniej 50 nt. Najmniejszy z nich (ORF 14) ma długość 122 nt, a największy (ORF 45) ma długość 2381 nt. Średnia długość ORF wynosi około 583 nt. Zidentyfikowane ORFy stanowią 91,86% zsekwencjonowanego genomu. ORFy zawarte są zarówno na nici wiodącej i nici komplementarnej, z czego 43 ORFy znajdują się na nici wiodącej, a 28 ORFów znajduje się na nici komplementarnej. Adnotację genomu φOS10 wykonywano z wykorzystaniem programu Artemis, w którym możliwa jest wizualizacja ORFów (Rycina 19). Każdej ORF nadano numery porządkowe od 1 do 71.
Dla każdej ORF zaznaczonej w sekwencji nukleotydowej wygenerowano z pomocą programu Artemis sekwencje białek przez nie kodowanych, dla których następnie z użyciem programu BLAST P wyszukiwano w bazach UniProt oraz NCBI rekordów o największym pokryciu, największej identyczności sekwencji oraz najmniejszej „E-wartości” (Podrozdziały 1.6.3 i 4.17). Wyniki adnotacji zestawiono w Tabeli 10. Domniemany produkt białkowy jednej ze zidentyfikowanych ORF został zaadnotowany jako integraza, co stanowiło następną przesłankę do postawienia hipotezy, że bakteriofag φOS10 jest łagodny (pierwszą były mętne łysinki, Podrozdział 5.1). Innymi przypuszczalnymi produktami białkowymi ORFów były między innymi białko portalowe (ORF 68) i terminaza (ORF 70). Nie udało się dopasować do białek o znanych funkcjach domniemanych produktów białkowych 19 ORFów spośród 71 zidentyfikowanych (co stanowi około 27%). Rezultat ten jest satysfakcjonujący zważywszy na fakt, że w innych przypadkach odsetek ORFów o niezidentyfikowanej funkcji może wynosić 33% [Dziewit i in., 2014] lub nawet 60% [Santos i in., 2011]. Przy przewidywaniu funkcji białek fagowych bardzo pomocna jest lokalizacja kodujących je ORFów, gdyż genomy wirusów mają budowę modułową, jak wspomniano w podrozdziale. 1.3. W związku z tym położenie ORFu o nieznanej funkcji, w otoczeniu ORFów, którym przypisuje się określone funkcje, jest wskazówką co do prawdopodobnej funkcji jej produktu białkowego. Należy podkreślić, że funkcje przypisane produktom zidentyfikowanych ORFów są tylko przypuszczalne, potwierdzenie tych funkcji wymaga testów eksperymentalnych. Obok przeszukania programem BLAST P jeszcze innym sposobem przewidywania funkcji białek jest dopasowanie ich sekwencji aminokwasowych do sekwencji domen białek, których funkcje określono eksperymentalnie. W niniejszej pracy wykorzystano do tego celu program HMMER (Podrozdział 1.6.4).
| ORF | Region kodujący (bp) |
Orientacja | Wielkość białka (aa) |
Prawdopodobna funkcja (motywy i domeny) |
Największe podobieństwo (program BLAST P) | |||
| Procent identyczności (aminokwasy§) (koordynaty motywu) |
e-value | Organizm | Numer w GenBank (numer pfam) (numer EC) (numer supfam) | |||||
| 1 | 77-301 | ← | 74 | hypothetical protein | 38/68(56%) | 3 * 10-18 | Serratia marcescens | WP_072264995.1 |
| 2 | 280-525 | ← | 81 | hypothetical protein (Protein of unknown function) |
61/81(75%) | 4 * 10-33 | Serratia marcescens | WP_118892208.1 (PF11684.8) |
| 3 | 550-1194 | ← | 214 | minor tail protein (coiled-coil motive) |
67/212(32%) | 7 * 10-28 | Rhodobacter phage RcSaxon | AKY02713.1 |
| 4 | 1236-1376 | ← | 46 | DEAD/DEAH box helicase (Zinc finger, C2H2 type) |
14/31(45%) | 3 * 10-10 | Roseomonas stagni | WP_092963283.1 (PF00096.26) |
| 5 | 1373-1627 | ← | 84 | DNA polymerase III subunit theta (DNA polymerase III, theta subunit) |
82/84(98%) | 8 * 10-62 | Serratia proteamaculans | WP_115059749.1 (PF06440.11) |
| 6 | 2037-2561 | ← | 174 | DUF2570 domain-containing protein (Phage shock protein B) |
123/166(74%) | 7 * 10-93 | Serratia sp. YD25 | WP_063919321.1 (PF06667.12) |
| 7 | 2558-3088 | ← | 176 | putative lysis protein (Phage lysozyme) |
136/175(78%) | 2 * 10-107 | Pectobacterium phage ZF40 | YP_007006943.1 (PF00959.19) |
| 8 | 3090-3386 | ← | 98 | phage 21-like group II holin (Bacteriophage holin family HP1) |
15/50(30%) | 1 * 10-06 | Bacteriophage APSE-7 | WP_016857351.1 (PF16080.5) |
| 9 | 3554-3928 | ← | 124 | hypothetical protein (RcsF lipoprotein) |
117/124(94%) | 4 * 10-91 | Serratia proteamaculans | WP_115058997.1 (PF16358.5) |
| 10 | 4225-4929 | ← | 234 | antitermination protein (Antitermination protein) |
218/234(93%) | 3 * 10-169 | Serratia proteamaculans | WP_115059758.1 (PF03589.13) |
| 11 | 4926-5282 | ← | 118 | RusA family crossover junction endodeoxyribonuclease (Endodeoxyribonuclease RusA) |
117/118(99%) | 8 * 10-90 | Serratia marcescens | WP_060431945.1 (PF05866.11) |
| 12 | 5279-6253 | ← | 324 | DUF968 domain-containing protein (Protein of unknown function DUF968) |
318/324(98%) | 0,0 | Serratia proteamaculans | WP_115059762.1 (PF06147.11) |
| 13 | 6250-7272 | ← | 340 | DNA-binding protein (Conserved phage Cterminus Phg_2220_C) |
313/339(92%) | 0,0 | Serratia liquefaciens ATCC 27592 | AGQ28749.1 (PF09524.10) |
| 14 | 7269-7391 | ← | 40 | DUF4222 domaincontaining protein (Domain of unknown function DUF4222) |
39/40(98%) | 3 * 10-29 | Serratia liquefaciens | WP_116690624.1 (PF13973.6) |
| 15 | 7441-8181 | ← | 246 | KilA-N domain-containing protein (KilA-N domain) |
240/245(98%) | 0,0 | Serratia liquefaciens | WP_116690625.1 (PF04383.13) |
| 16 | 8196-8468 | ← | 90 | hypothetical protein | 88/90(98%) | 6 * 10-68 | Serratia liquefaciens | WP_116690626.1 |
| 17 | 8477-8791 | ← | 104 | hypothetical protein | 98/104(94%) | 4 * 10-72 | Serratia proteamaculans | WP_115059769.1 |
| 18 | 8809-8961 | ← | 50 | XRE family transcriptional regulator | 49/50(98%) | 7 * 10-37 | Serratia proteamaculans | WP_115059771.1 |
| 19 | 9156-9896 | → | 246 | XRE family transcriptional regulator (Cro/C1-type HTH DNA-binding domain) |
245/246(99%) (18-78) |
0,0 | Serratia proteamaculans | WP_115059773.1 (PF13443.6) |
| 20 | 10433-10696 | → | 87 | glycosyl transferase family 1, partial (Putative pyruvate format-lyase activating enzyme DUF1786) |
18/40(45%) | 1 * 10-08 | Desulfosporosinus sp. BICA1-9 | KJS90102.1 (PF08735.10) |
| 21 | 10714-10923 | → | 69 | lysine-2,3-aminomutase, EmpB | 57/69(83%) | 2 * 10-43 | Serratia grimesii | WP_037419410.1 |
| 22 | 10953-11081 | → | 42 | hypothetical protein HMPREF1564_3580 (Helical box domain of E3 ubiquitin-protein ligase HECW1) |
28/38(74%) | 1 * 10-19 | Providencia alcalifaciens R90-1475 | EUD08463.1 (PF18436.1) |
| 23 | 11487-11699 | → | 70 | hypothetical protein (Ribosomal protein L33) |
67/70(96%) | 2 * 10-52 | Serratia proteamaculans | WP_115059007.1 (PF00471.20) |
| 24 | 11693-11836 | → | 47 | hypothetical protein M495_10455 (transmembrane motive) |
47/47(100%) | 8 * 10-36 | Serratia liquefaciens ATCC 27592 | AGQ30852.1 |
| 25 | 11839-12075 | → | 78 | hypothetical protein | 78/78(100%) | 1 * 10-60 | Serratia liquefaciens | WP_116690632.1 |
| 26 | 12079-12921 | → | 280 | chromosome partitioning protein ParB (Crp-like helix-turnhelix domain) |
274/280(98%) | 0,0 | Serratia proteamaculans | WP_012006454.1 (PF13545.6) |
| 27 | 12905-13375 | → | 156 | Gp37 (tail fiber protein) | 49/113(43%) | 1 * 10-25 | Escherichia virus HK97 | NP_037722.1 |
| 28 | 13372-14019 | → | 215 | hypothetical protein (ASCH domain) |
145/214(68%) | 4 * 10-91 | Serratia marcescens | WP_101456383.1 (PF04266.14) |
| 29 | 14019-14240 | → | 73 | molecular chaperone DnaJ (Restriction alleviation protein Lar) |
64/70(91%) | 4 * 10-50 | Serratia proteamaculans | WP_085115658.1 (PF14354.6) |
| 30 | 14233-14496 | → | 87 | hypothetical protein | 73/87(84%) | 3 * 10-17 | Serratia marcescens | WP_141958176.1 |
| 31 | 14489-14758 | → | 89 | hypothetical protein | 72/89(81%) | 4 * 10-51 | Serratia marcescens | WP_060429489.1 |
| 32 | 14777-15259 | → | 160 | putative phage replication protein | 17/48(35%) | 2 * 10-06 | Lactobacillus phage phiPYB5 | YP_009167807.1 |
| 33 | 15259-15450 | → | 63 | hypothetical protein BVG97_16260 ead/Ea22-like family protein |
52/59(88%) 32/66(48%) |
3 * 10-38 4 * 10-12 |
Serratia marcescens Serratia marcescens |
ASL89067.1 WP_052475410.1 |
| 34 | 15443-15979 | → | 178 | ead/Ea22-like family protein (Ead/Ea22-like protein) |
48/57(84%) | 1 * 10-32 | Serratia quinivorans | WP_112347612.1 (PF13935.6) |
| 35 | 15980-16234 | → | 84 | hypothetical protein | 78/84(93%) | 1 * 10-62 | Serratia plymuthica | WP_064798928.1 |
| 36 | 16244-16945 | → | 233 | putative pmgU (Xeroderma pigmentosum group Bhelicase damage recognition domain) |
25/43(58%) | 2 * 10-16 | Escherichia coli 2-474-04_S4_C2 | KDZ03155.1 (PF18458.1) |
| 37 | 16991-17260 | → | 89 | uncharacterised protein | 87/89(98%) | 1 * 10-66 | Serratia marcescens | SAY41700.1 |
| 38 | 17276-17494 | → | 72 | hypothetical protein (Ribonuclease R winged-helix domain) |
66/69(96%) | 5 * 10-49 | Serratia sp. | WP_046372826.1 (PF08461.10) |
| 39 | 17514-17723 | → | 69 | hypothetical protein | 68/69(99%) | 6 * 10-53 | Serratia liquefaciens | WP_116691155.1 |
| 40 | 17726-18106 | → | 126 | hypothetical protein | 125/126(99%) | 2 * 10-98 | Serratia liquefaciens | WP_116690638.1 |
| 41 | 18122-18304 | → | 60 | ANR family transcriptional regulator | 59/60(98%) | 2 * 10-44 | Serratia quinivorans | WP_112347617.1 |
| 42 | 18307-18969 | → | 220 | DNA methyltransferase (MT-A70) (S-adenosyl-Lmethionine-dependent methyltransferases) |
208/220(95%) | 4 * 10-164 | Serratia liquefaciens | WP_046372823.1 (PF05063.14) (53335) |
| 43 | 19351-20514 | → | 387 | site-specific integrase (Phage integrase family) (Lambda integrase-like, catalytic core) |
375/387(97%) | 0,0 | Serratia grimesii | WP_037419381.1 (PF00589.22) (56350) |
| 44 | 20794-21699 | ← | 301 | hypothetical protein | 262/301(87%) | 0,0 | Serratia marcescens | WP_060706314.1 |
| 45 | 21700-24081 | ← | 793 | tail lysin | 83 to 176 25/95(26%) 154 to 220 19/76(25%) 295 to 306 6/12(50%) 1155 to 1219 20/71(28%) 560 to 567 5/8(63%) |
1 * 10-04 | Bacillus phage SageFayge | YP_009280906.1 |
| 46 | 24191-24364 | → | 57 | lysyl-tRNA synthetase, class I (transmembrane domain) |
43/56(77%) | 5 * 10-32 | Photorhabdus luminescens BA1 | EYU16219.1 |
| 47 | 24402-24674 | → | 90 | transcriptional regulator (lambda repressor-like DNA-binding domains) |
84/90(93%) | 2 * 10-64 | Serratia marcescens | WP_072269370.1 (1.10.260.40) |
| 48 | 24684-25814 | → | 376 | Acyltransferase (Acyltransferase family) |
339/376(90%) | 0,0 | Serratia marcescens | WP_072269371.1 (PF01757.22) |
| 49 | 25845-26333 | ← | 162 | phage tail protein, partial (Pectinesterase domain) |
51/62(82%) | 8 * 10-36 | Bacillus sp. SRB_28 | RAN85254.1 (EC 3.1.1.11) |
| 50 | 26377-27051 | ← | 224 | DUF2313 domain-containing protein (DUF2313) |
211/224(94%) | 2 * 10-165 | Serratia marcescens | WP_060441827.1 (PF10076.9) |
| 51 | 27048-28196 | ← | 382 | baseplate J/gp47 family protein (Baseplate J-like protein) |
368/382(96%) | 0,0 | Serratia sp. C-1 | WP_062790438.1 (PF04865.14) |
| 52 | 28200-28637 | ← | 145 | putative tail protein (Phage protein GP46) |
19 to 98 43/82(52%) 119 to 136 8/18(44%) 53 to 66 4/14(29%) |
3 * 10-23 | Enterobacteria phage SfI | WP_000424732.1 (PF07409.12) |
| 53 | 28634-29224 | ← | 196 | Phage baseplate assembly protein V (Bacteriophage Mu Gp45 protein) (Phage spike trimer) (Acetyl-CoAcarboxylase domain) |
182/196(93%) (19 to 117) (126 to 163) (83 to 145) |
2 * 10-132 | Serratia proteamaculans | SMB46877.1 (PF06890.12) (PF18715.1) (EC 6.4.1.2) |
| 54 | 29224-30294 | ← | 356 | phage tail protein (Phage late control gene D protein GPD) |
345/356(97%) | 0,0 | Serratia proteamaculans | WP_085118850.1 (PF05954.11) |
| 55 | 30291-31694 | ← | 467 | dna circulation family protein (DNA circularisation protein N-terminus) |
421/467(90%) | 0,0 | Lasius niger | KMQ87046.1 (PF07157.12) |
| 56 | 31731-33650 | ← | 639 | lytic transglycosylase domain-containing protein (MSP7-like protein C-terminal domain) |
385/655(59%) | 0,0 | Serratia sp. Nf2 | WP_107228138.1 (PF12948.7) |
| 57 | 33772-34062 | ← | 96 | phage tail assembly protein (Phage tail assembly chaperone proteins, E, or 41 or 14) |
92/96(96%) | 7 * 10-71 | Serratia sp. C-1 | WP_062790456.1 (PF10109.9) |
| 58 | 34064-34432 | ← | 122 | phage tail protein (Phage tail tube protein) |
122/122(100%) | 1 * 10-92 | Serratia sp. C-1 | WP_062790459.1 (PF10618.9) |
| 59 | 34442-35947 | ← | 501 | phage tail protein (Phage tail sheath protein beta-sandwich domain) (Phage tail sheath protein subtilisin-like domain) (Phage tail sheath C-terminal domain) |
474/501(95%) (99 - 246) (210 - 373) (381 - 495) |
0,0 | Serratia proteamaculans | WP_085118840.1 (PF17481.2) (PF04984.14) (PF17482.2) |
| 60 | 35944-36138 | ← | 64 | DUF2635 domain-containing protein (DUF2635) |
59/64(92%) (3 - 48) |
4 * 10-44 | Serratia sp. C-1 | WP_062790465.1 (PF10948.8) |
| 61 | 36143-36685 | ← | 180 | ATP-binding protein (coiled-coil motive) |
167/180(93%) (76 - 110) |
2 * 10-129 | Serratia sp. Nf2 | WP_107228160.1 |
| 62 | 36682-37026 | ← | 114 | head-to-tail joining protein (Phage tail proteins domain) |
34/104(33%) | 7 * 10-10 | Rhodobacter phage RcRhea | YP_009213476.1 (EC 2.40.10.180) |
| 63 | 37026-37448 | ← | 140 | hypothetical protein (putative capsid protein) |
109/140(78%) | 2 * 10-56 | Serratia symbiotica | WP_040264829.1 (PF12226.8) |
| 64 | 37450-38499 | ← | 349 | major capsid protein (Phage major capsid |
322/349(92%) | 0,0 | Citrobacter freundii | WP_115601857.1 (PF03864.15) (3.15.30.10) (3.30.1930.10) (3.15.30.10) |
| 65 | 38603-39004 | ← | 133 | head decoration protein (Bacteriophage lambda head decoration protein D) |
123/133(92%) | 7 * 10-94 | Serratia marcescens | WP_060425447.1 (PF02924.14) |
| 66 | 39004-39603 | ← | 199 | Uncharacterised protein | 168/201(84%) | 3 * 10-89 | Serratia marcescens | CVA09345.1 |
| 67 | 39607-40467 | ← | 286 | S49 family peptidase (2-enoyl-CoA Hydratase) |
272/285(95%) | 0,0 | Serratia symbiotica | WP_006708310.1 (3.90.226.10) |
| 68 | 40464-42044 | ← | 526 | phage portal protein (Phage portal protein, lambda family) |
503/526(96%) | 0,0 | Serratia symbiotica | WP_040262924.1 (PF05136.13) |
| 69 | 42110-42373 | ← | 87 | phage head-tail adapter protein (Head-to-tail joining protein W) |
72/87(83%) | 1 * 10-52 | Photorhabdus luminescens | WP_105396969.1 (PF02831.15) |
| 70 | 42382-44361 | ← | 659 | phage terminase large subunit family protein (Phage terminase large subunit GpA) |
635/659(96%) | 0,0 | Serratia marcescens | WP_060425444.1 (PF05876.12) |
| 71 | 44333-44932 | ← | 199 | terminase small subunit (Homeodomain-like domain) |
50/201(25%) | 4 * 10-06 | Synechococcus phage S-LBS1 | ATS93173.1 (PF13384.6) |
Za pomocą narzędzia BLAST P udało się określić możliwe funkcje aż 54 ORFów. Dalsza analiza, bazująca na obecności domen białkowych i ukrytych modeli Markowa, umożliwiła określenie potencjalnych funkcji dla kolejnych 7 ORFów [Söding, 2004].
Na drodze analizy bioinformatycznej z użyciem programów BLAST P oraz HMMER przeprowadzono adnotację ORFów, co umożliwiło poznanie potencjalnych funkcji domniemanych produktów białkowych:
ORF 3 – potencjalne białko o długości 214 aa, będące produktem tej ORF, wykryto podobieństwo tego białka do białka strukturalnego ogonka faga Rhodobacter RcSaxon (e = 7 * 10-28) (Gene Bank AKY02713.1). Białko to uczestniczy w etapie składania
wirusowych cząstek potomnych i jest niezbędne do wytworzenia funkcjonalnego ogonka [Bollivar i in., 2016] (Podrozdział 1.4);
ORF 4 – koduje potencjalne białko funkcji helikazy DEAD/DEAH (e = 3 * 10-10) długości 46 aa o prawdopodobnej (Gene Bank WP_092963283.1), białko to posiada motyw palca cynkowego typu C2H2 (pfam PF00096.26), który jest identyfikowany m.in. u regulatorów transkrypcji [Rohozková i in., 2014];
ORF 5 – domniemany produkt tej ORF o długości 84 aa na podstawie podobieństwa sekwencji aminokwasowych dopasowano do podjednostki theta polimerazy III DNA (e = 8 * 10-62) (Gene Bank WP_115059749.1; pfam PF06440.11). Podjednostka θ jest jedną z 3 podjednostek tworzących heterodimer polimerazy III DNA razem z podjednostkami α i ε [Slater i in., 1994];
ORF 6 – prawdopodobny produkt tego genu o długości 174 aa wykazuje podobieństwo do białka Phage shock protein B (e = 7 * 10-93) (Gene Bank WP_063919321.1; pfam PF06667.12), którego gen go kodujący zidentyfikowano w genomie Serratia sp. YD25. Ekspresja białek z grupy Psp (ang. phage shock protein) zachodzi pod wpływem czynników stresowych takich jak: szok cieplny, obecność etanolu w otoczeniu, szok osmotyczny lub infekcja fagowa [Brissette i in., 1991];
ORF 7 – potencjalny produkt białkowy o długości 176 aa powstający na drodze ekspresji ORF 7, wykazuje podobieństwo do domeny lizozymu faga Pectobacterium ZF40 (e = 2 * 10-107) (Gene Bank YP_007006943.1; pfam PF00959.19);
ORF 8 – przypuszczalny produkt białkowy ma długość 98 aa, który wykazuje podobieństwo do białka holiny grupy II (e = 1 * 10-06) (Gene Bank WP_016857351.1) zawierającego domenę właściwą dla bakteriofagowych holin z rodziny HP1 (pfam PF16080.5). Mechanizm działania tego białka polega na formowaniu porów w strukturze błony komórkowej gospodarza, dzięki czemu możliwe jest dotarcie fagowego lizozymu do ściany komórkowej [Esposito i in., 1996]. Oba te białka kodowane są przez geny zlokalizowane blisko siebie (w
tym przypadku są to następujące po sobie ORF 7 i ORF 8);
ORF 9 – w jego domniemanym produkcie białkowym o długości 124 aa wykryto podobieństwo do lipoproteiny RcsF (e = 4 * 10-91) (Gene Bank WP_115058997.1; pfam PF16358.5);
ORF 10 – hipotetyczne białko kodowane przez tą ORF ma długość 234 aa. Wykazuje podobieństwo do białka antyterminatora (e = 3 * 10-169) (Gene Bank WP_115059758.1; pfam PF03589.13) kodowanego w genomie S. proteamaculans. Mechanizm działania antyterminatora bazuje na interakcji tego białka z polimerazą RNA, co prowadzi do pominięcia sekwencji terminatora i dalszej transkrypcji [Roberts i in., 1998];
ORF 11 – potencjalne białko kodowane przez tą ORF ma długość 118 aa. Białko wykazuje podobieństwo do endodeoksyrybonukleazy RusA (e = 8 * 10-90) (Gene Bank WP_060431945.1) kodowanej przez S. marcescens, Białko o takiej funkcji jest u organizmów komórkowych zaangażowane w naprawę chromosomalnego DNA na drodze rekombinacji homologicznej [Rafferty i in., 2003]. Jak wspomniano w Podrozdziale 1.3 fagi wykazują mozaikową budowę genomu, Jest to możliwe dzięki fagowym rekombinazom
przeprowadzającym wymianę modułów funkcjonalnych;
ORF 13 – potencjalne białko o długości 340 aa będące produktem ORF 13 wykazuje podobieństwo do białka wiążącego DNA (e = 0,0) (Gene Bank AGQ28749.1) kodowanego przez S. liquefaciens ATCC 27592;
ORF 15 – hipotetyczne białko będące produktem tej ORF ma długość 246 aa. W sekwencji aminokwasowej tego białka wykryto podobieństwo do domeny KilA-N (e = 0,0) (Gene Bank WP_116690625.1; pfam PF04383.13) kodowanego przez S. liquefaciens;
ORF 18 – białko to będące przypuszczalnym produktem ORF 18 ma długość 50 aa. Na podstawie analizy sekwencji aminokwasowych za pomocą programu BLAST P wykryto podobieństwo białka do regulatora transkrypcji z rodziny białek XRE (ang. xenobiotic responsive element) (e = 7 * 10-37) (Gene Bank WP_115059771.1) kodowanego przez S. proteamaculans. Białka z tej grupy indukowane są pod wpływem substancji
ksenobiotycznych [Matsushita i in., 1993];
ORF 19 – białko to będące prawdopodobnym produktem ORF 19 ma długość 246 aa. Podobnie jak w przypadku ORF 18, na podstawie analizy programem BLAST P wykryto podobieństwo jego sekwencji aminokwasowych do regulatora transkrypcji z rodziny białek XRE (e = 0,0) (Gene Bank WP_115059773.1). U domniemanego produktu ORF 19 zidentyfikowano też domenę HTH wiążącą DNA typu Cro/C1 (e = 2,4 * 10-05) (pfam PF13443.6) – białko to jest więc najprawdopodobniej przełącznikiem uczestniczącym w decyzji o wejściu w cykl lityczny lub lizogenny [Echols i in., 1973];
ORF 20 – domniemany produkt tej ORF o długości 87 aa wykazuje podobieństwo do białka o funkcji glikozylotransferazy (e = 1 * 10-08) (Gene Bank KJS90102.1). Znaczenie tego białka w cyklu infekcyjnym nie jest bliżej poznane;
ORF 21 – hipotetyczne białko o długości 69 aa wykazuje podobieństwo do białka pełniącego funkcję lizyno-2,3-aminomutazy (e = 2 * 10-43) (Gene Bank WP_037419410.1) kodowanego przez Serratia grimesii. Zadaniem tego typu białek jest transport grupy aminowej z pozycji α w pozycję β cząsteczki lizyny [Lepore i in., 2005];
ORF 26 – przypuszczalny produkt białkowy tej ORF ma długość 280 aa i wykazuje podobieństwo do białka partycyjnego ParB (e = 0,0) (Gene Bank WP_012006454.1) kodowanego przez S. proteamaculans;
ORF 27 – domniemany produkt białkowy ORF 27 ma długość 156 aa, wykazuje
podobieństwo do białka włókienek ogonka (e = 1 * 10-25) (Gene Bank NP_037722.1) kodowanego przez faga Escherichia HK97. Włókienka ogonka rozpoznają na powierzchni bakterii specyficzne receptory [Krasnykh i in., 2001];
ORF 28 – przypuszczalne białko będące produktem tej ORF ma długość 215 aa. wykazuje podobieństwo do domeny ASCH (e = 4 * 10-91) (Gene Bank WP_101456383.1 kodowanego przez S. marcescens), która występuje u białek procesujących RNA [Iyer i in., 2005];
ORF 29 – domniemany produkt ORF 29 o długości 73 aa wykazuje podobieństwo do białka chaperonowego DnaJ uczestniczącego w prawidłowym fałdowaniu białek (e = 4 * 10-50) (Gene Bank WP_085115658.1) [Cyr i in., 1994];
ORF 32 – przypuszczalny produkt białkowy kodowany przez tą ORF ma długość 160 aa i wykazuje podobieństwo do białka replikacyjnego (e = 2 * 10-06) (Gene Bank YP_009167807.1). Mechanizm replikacji omówiono w Podrozdziale 1.4;
ORF 33 – domniemany produkt białkowy o długości 63 aa będący produktem ORF 33 dopasowano na podstawie podobieństwa sekwencji aminokwasowych do białka z rodziny ead/Ea22-podobnych. Przedstawiciele tej rodziny są białkami wczesnymi replikacji
bakteriofagów λ oraz P22 [ncbi.nlm.nih.gov] (e = 4 * 10-12) (Gene Bank WP_052475410.1);
ORF 34 – białko będące potencjalnym produktem ORF 34 ma długość 178 aa, w oparciu o
podobieństwo sekwencji aminokwasowych dopasowano je do białek z rodziny ead/Ea22podobnych (patrz ORF 33) (e = 1 * 10-32) (Gene Bank WP_112347612.1; pfam PF13935.6);
ORF 36 – w domniemanym produkcie białkowym o długości 233 aa kodowanym przez tą
ORF odnotowano podobieństwo sekwencji aminokwasowej do domeny odpowiedzialnej za
rozpoznawanie uszkodzeń w DNA występującą w helikazach z grupy B (e = 2 * 10-16)
(Gene Bank KDZ03155.1; pfam PF18458.1) [Seki i in., 1988];
ORF 41 – hipotetyczne białko o długości 60 aa kodowane przez tą ORF dopasowano w
oparciu o podobieństwo sekwencji aminokwasowych do białek z rodziny regulatorów
transkrypcji ANR (e = 2 * 10-44) (GeneBank WP_112347617.1);
ORF 42 – produkt tej ORF został doświadczalnie scharakteryzowany. Jego długość wynosi 220 aa. Wykryto u niego (Gene Bank WP_046372823.1; pfam PF05063.14) podobieństwo do domeny MT-A70 (e = 4 * 10-164) obecnej w białkach z rodziny metylotransferaz (MTaz) S-adenozylo-L-metionino-zależnych (supfam 53335). U wirusów
prokariotycznych wykryte białko może przeprowadzać modyfikacje adenin w genomie fagowym, dzięki czemu niemożliwe staje się rozpoznanie specyficznych sekwencji przez enzymy restrykcyjne gospodarza [Wilson i in., 1991], nie wyklucza się jednak innej funkcji poznanej MTazy. Gen badanego białka sklonowano, a następnie ustalono, że badane białko jest w pełni funkcjonalną MTazą DNA o specyficzności GATC [Radlińska, dane nieopublikowane]. Taką samą specyficzność ma MTaza typu Dam w rodzaju Serratia [Ostendorf i in., 1999]. MTaza Dam Serratia i ORF42 nie wykazują podobieństwa sekwencji aminokwasowej;
ORF 43 – domniemane białko będące produktem ORF 43 ma długość 387 aa i wykazuje podobieństwo do białka z rodziny integraz fagowych (e = 0,0) (Gene Bank WP_037419381.1; pfam PF00589.22) kodowanego przez S. grimesii, zawiera rdzeń katalityczny integraz fagów lambda-podobnych (supfam 56350). Integrazy fagów lambda-podobnych należą do grupy rekombinaz tyrozynowych, które za pośrednictwem aktywnej katalitycznie tyrozyny przeprowadzają cięcie rozpoznanej sekwencji attB w chromosomie gospodarza oraz sekwencji attP w genomie fagowym, co prowadzi do miejscowo specyficznej rekombinacji
między obydwoma sekwencjami i w konsekwencji do wejścia bakteriofaga w stan lizogenii
(Podrozdział 1.5.1). Do swojej aktywności zazwyczaj wymagają białek pomocniczych
kodowanych na chromosomie bakteryjnym lub w genomie fagowym; białka te biorą też
udział w wycięciu profaga [Groth & Calos, 2004];
ORF 45 – przypuszczalny produkt białkowy tej ORF ma długość 793 aa i jest najdłuższym domniemanym białkiem spośród wszystkich rozpatrywanych w niniejszej pracy. Analiza jego sekwencji aminokwasowej z użyciem programu BLAST P wskazuje na podobieństwo do endolizyny ogonka bakteriofaga SageFayge infekującego bakterie z rodzaju Bacillus (e = 1 * 10-04) (Gene Bank YP_009280906.1);
ORF 46 – domniemane białko kodowane przez ORF 46 ma długość 57 aa i wykazuje
podobieństwo do syntetaz lizylo-tRNA klasy I (e = 5 * 10-32) (Gene Bank EYU16219.1). Białka z tej rodziny przyłączają cząsteczki aminokwasu lizyny tRNA tworząc amino-acylotRNA wykorzystywane później w syntezie białek na rybosomach [Onesti i in., 1995];
ORF 47 – przypuszczalny produkt białkowy tego genu ma długość 90 aa. Na podstawie
analizy bioinformatycznej wykazano jego podobieństwo do regulatorów transkrypcji
(e = 2 * 10-64) (Gene Bank WP_072269370.1), rozpoznano w nim domenę represora lambdapodobnego wiążącą DNA (EC 1.10.260.40);
ORF 48 – hipotetyczne białko kodowane na ORF nr 48 o długości 376 aa dopasowano w
oparciu o podobieństwo sekwencji aminokwasowych do białka będącego acetylotransferazą
(e = 0,0) (Gene Bank WP_072269371.1). Białko acetylotransferaza należy do rodziny
acetylotransferaz (pfam PF01757.22);
ORF 49 – przypuszczalny produkt białkowy o długości 162 aa wykazuje podobieństwo do
białka ogonka (e = 8 * 10-36) (Gene Bank RAN85254.1). W obrębie sekwencji aminokwasowej tego białka odnotowano podobieństwo do domeny pektynoesterazy (EC 3.1.1.11). Potencjalną funkcją tego białka może być hydroliza struktur ściany komórkowej w trakcie penetracji;
ORF 51 – domniemane białko będące produktem tego genu jest długości 382 aa. Na
podstawie podobieństwa sekwencji aminokwasowej tego białka dopasowano je do białka
budującego płytkę podstawową (ang. baseplate) (e = 0,0) (Gene Bank WP_062790438.1). Jest to struktura stanowiąca zakończenie ogonka, która bezpośrednio styka się z powierzchnią
infekowanej bakterii. Uczestniczy ona w rozpoznaniu komórki gospodarza, adsorpcji, transdukcji sygnału o prawidłowym zaadsorbowaniu do komórki oraz we wstrzyknięciu genomu wirusowego do komórki [Kostyuchenko i in., 2003];
ORF 52 – hipotetyczny produkt białkowy tej ORF o długości 145 aa dopasowano w oparciu
o podobieństwo sekwencji aminokwasowych do białka strukturalnego ogonka (e = 3 * 10-23) (Gene Bank WP_000424732.1) o bliżej nieokreślonej funkcji;
ORF 53 – domniemane białko będące produktem tej ORF ma długość 196 aa. Sekwencja
aminokwasowa tego białka wykazuje podobieństwo do sekwencji białka budującego płytkę
podstawową (ang. baseplate) (e = 2 * 10-132) (Gene Bank SMB46877.1) (patrz ORF 51);
ORF 54 – hipotetyczne białko będące produktem tej ORF ma długość 356 aa. Białko to w
oparciu o podobieństwo sekwencji aminokwasowych zostało dopasowane do białka strukturalnego ogonka (e = 0,0) (Gene Bank WP_085118850.1) o bliżej nieokreślonej funkcji;
ORF 55 – produkt białkowy tej ORF ma długość 467 aa. Na podstawie podobieństwa sekwencji aminokwasowej tego białka dopasowano je do rodziny białek cyrkulujących DNA (e = 0,0) (Gene Bank KMQ87046.1). Ich rolą jest nadanie kolistej struktury genomowi bakteriofaga i wraz z innymi genami wczesnymi ulega ekspresji niedługo po wprowadzeniu do komórki gospodarza. W tym procesie przeprowadzanym przez białka z tej rodziny dochodzi do ligacji końców genomu (u niektórych bakteriofagów zachodzi to w sekwencji cos) [Novick i in., 2010];
ORF 56 – jej potencjalny produkt ma długość 639 aa, zaś jego sekwencja wykazuje podobieństwo do domeny litycznej transglikozylazy (e = 0,0) (GeneBank WP_107228138.1). Białko to najprawdopodobniej może uczestniczyć w lizie komórki na drodze degradacji peptydoglikanu.
ORF 57 – produkt tej ORF o długości 96 aa, wykryto w nim podobieństwo do fagowych białek składania (e = 7 * 10-71) (Gene Bank WP_062790456.1) posiada domenę chaperonową fagowego białka E (pfam PF10109.9). Białko to uczestniczy w prawidłowym fałdowaniu monomerów białkowych tworzących ogonek u bakteriofagów z rodziny Myoviridae [pfam.xfam.org];
ORF 58 – potencjalny produkt białkowy tej ORF o długości 122 aa wykazuje podobieństwo sekwencji aminokwasowych do białka strukturalnego ogonka (e = 1 * 10-92) (Gene Bank WP_062790459.1) o bliżej nieokreślonej funkcji;
ORF 59 – potencjalny produkt ORF 59 jest białkiem fagowym o długości 501 aa (e = 0,0) (Gene Bank WP_085118840.1). W sekwencji aminokwasowej tego potencjalnego białka
odnotowano podobieństwo do 3 domen, które mogą w tym białku występować. Domeny te
występują w białkach budujących pochewkę ogonka (pfam PF17481.2, PF04984.14 i
PF17482.2);
ORF 61 – jej hipotetyczny produkt białkowy o długości 180 aa dopasowano według
podobieństwa sekwencji aminokwasowej do białka pomocniczego wiążącego ATP (e = 2 * 10-129) (Gene Bank WP_107228160.1);
ORF 62 – domniemane białko będące produktem tej ORF to ma długość 114 aa i wykazuje
podobieństwo sekwencji aminokwasowej do białka pełniącego funkcję adaptorową – umożliwia przyłączenie ogonka do główki (e = 7 * 10-10) (Gene Bank YP_009213476.1);
ORF 63 – białko to o długości 140 aa jest hipotetycznym produktem ORF 63, na podstawie analizy bioinformatycznej podobieństwa sekwencji aminokwasowej tego białka dopasowano je do białka kapsydu (e = 2 * 10-56) (Gene Bank WP_040264829.1; pfam PF12226.8);
ORF 64 – białko to o długości 349 aa, będące potencjalnym produktem ORF 64, dopasowano w oparciu o podobieństwo sekwencji aminokwasowej do białka kapsydu (e = 0,0)
(Gene Bank WP_115601857.1; pfam PF03864.15);
ORF 65 – produkt białkowy tej ORF o długości 133 aa dopasowano na podstawie
podobieństwa sekwencji aminokwasowych do białka dekorującego główkę (e = 7 * 10-94) (Gene Bank WP_060425447.1; pfam PF02924.14);
ORF 67 – przypuszczalne białko stanowiące produkt ORF 67 ma długość 286 aa, zaś na drodze analizy podobieństwa sekwencji aminokwasowej tego białka dopasowano je do białka peptydazy z rodziny S49 (e = 0,0) (Gene Bank WP_006708310.1) o aktywności hydratazy 2-enoilo-CoA (EC 3.90.226.10). Białko to najprawdopodobniej uczestniczy w dojrzewaniu kapsydu poprzez degradację białek rusztowania wewnątrz prokapsydu umożliwiając wprowadzenie przez kompleks terminazy genomu do główki kapsydu [Cerritelli i in., 2003;
Johnson, 2010];
ORF 68 – jej hipotetyczny produkt białkowy o długości 526 aa wykazuje podobieństwo
(ustalone w oparciu o analizę z użyciem programu BLAST P) sekwencji aminokwasowej do
sekwencji białka portalowego z rodziny białek bakteriofagów lambda podobnych (e = 0,0)
(Gene Bank WP_040262924.1; pfam PF05136.13). Białko to uczestniczy w pakowaniu
genomu do prokapsydu, stanowi kanał prowadzący do wnętrza prokapsydu i umożliwia
przyłączenie się kompleksowi terminazy, po czym następuje translokacja genomu do
prokapsydu [Fujisawa & Morita, 1997] (Podrozdział 1.4);
ORF 69 – domniemane białko kodowane na tej ORF ma długość 87 aa. Analiza sekwencji
aminokwasowej z użyciem programu BLAST P wskazuje, iż jest to białko podobne do białka
uczestniczącego w przyłączeniu ogonka do główki (ang. head-tail joining protein) (e = 1 * 10-52) (Gene Bank WP_105396969.1; pfam PF02831.15);
ORF 70 – domniemany produkt białkowy ORF 70 to ma długość 659 aa, zaś jego sekwencja aminokwasowa wykazuje podobieństwo do sekwencji aminokwasowej białka będącego dużą podjednostką terminazy (e = 0,0) (Gene Bank WP_060425444.1). Wraz z małą podjednostką, duża podjednostka tworzy kompleks terminazy – gdzie: mała podjednostka terminazy rozpoznaje na nici replikowanego genomu sekwencje cos, zaś duża podjednostka w
połączeniu z małą podjednostką łączy się z białkiem portalowym, przeprowadza translokację
genomu do główki prokapsydu oraz odcina w miejscu cos zapakowany genom od konkatameru; po czym przyłącza się do kolejnej, niewypełnionej jeszcze główki fagowej [Sun i in., 2010] (Podrozdział 1.4);
ORF 71 – domniemany produkt ORF 71 o długości 199 aa wykazuje podobieństwo
sekwencji aminokwasowej do małej podjednostki terminazy (e = 4 * 10-06) (Gene Bank ATS93173.1), której funkcję opisano powyżej (patrz ORF 70);
Nie udało się przewidzieć funkcji produktów ORFów o numerach: 1, 2, 12, 14, 16 17, 22, 23,
24, 25, 31, 35, 37, 39 , 40, 44, 50, 60 i 66.
Uzyskany plik FASTA białek φOS10 zaimplementowano do programu VIRFAM (Podrozdziały 1.6.6 i 4.17.3), skąd otrzymano przyporządkowanie φOS10 do rodziny. Program VIRFAM przypisał φOS10 do rodziny Myoviridae (Rycina 20); niemniej jak wspomniano w Podrozdziale 1.2, w ciągu ostatnich kilkunastu miesięcy ustanowiono 2 nowe rodziny w rzędzie Caudovirales (tj. Ackermannviridae i Herelleviridae) o wielu cechach przypisywanym dotychczas tylko rodzinie Myoviridae; w związku z czym aktualnie dostępne programy bioinformatyczne mogą przypisywać badane bakteriofagi do rodziny Myoviridae, podczas gdy przypisanie powinno nastąpić do rodziny Ackermannviridae lub Herelleviridae. Przyporządkowanie φOS10 do rodziny Myoviridae nie jest w pełni uprawnione i wymaga kolejnego podejścia, gdy dostępne programy bioinformatyczne zostaną zaktualizowane.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.