Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Metody/Badanie jednego etapu replikacji (One-Step Growth) faga φOS10/Określenie czasu latencji i plonu fagowego
Odmładzanie nocnej hodowli szczepu OS10 wykonywano w pożywce płynnej LB wzbogaconej o chlorek wapnia o końcowym stężeniu 2 mM, którego dodatek zwiększał wydajność adsorpcji cząstek fagowych do komórek szczepu Serratia sp. OS10. Po uzyskaniu OD 600 = 0,5 przenoszono 9,9 ml odmłodzonej hodowli do kolby adsorpcyjnej. Do kolby adsorpcyjnej dodawano 0,1 ml zawiesiny fagowej o mianie 107 PFU/ml, jednocześnie zaczynając mierzenie czasu. Mieszaninę inkubowano w wytrząsarce w temperaturze 20 °C. Po 5 minutach przenoszono 0,1 ml zawartości z kolby adsorpcyjnej do „kolby A” zawierającej 9,9 ml pożywki płynnej LB, której zawartość następnie inkubowano w temperaturze 20 °C z wytrząsaniem (kolba A stanowiła jednocześnie odmłodzenie hodowli oraz 100-krotne rozcieńczenie mieszaniny z kolby adsorpcyjnej). Po upływie 5 minut
pobierano z „kolby A” mieszaninę w ilości: (i) 1 ml do probówki opisanej literą „K” zawierającej 50 µl chloroformu[1]; (ii) 100 µl do probówki oznaczonej symbolem „A1” zawierającej 150 µl nocnej hodowli OS10 oraz po określeniu czasu latencji w następnych podejściach dodawano (iii) 1 ml do „kolby B” zawierającej 9,9 ml jałowej pożywki płynnej
LB (co stanowi 10-krotne rozcieńczenie zawartości kolby A). Zawartość probówki opisanej literą „K” mieszano przez około 1 min, po czym przechowywano w lodzie – preparat ten stanowił układ odniesienia, obrazujący ilość niezaadsorbowanych cząstek fagowych. Zawartość kolby B wytrząsano równolegle z wytrząsaniem kolby A, a po kolejnych 5 minutach 1 ml zawartości z kolby B przenoszono do kolby C zawierającej 9 ml jałowej pożywki LB. Do probówki z oznaczeniem „A1” po wymieszaniu i 5-minutowej inkubacji dodawano 4 ml agaru półpłynnego, mieszano i rozprowadzano po agarze dolnym na szalce podpisanej numerem seryjnym „A1” zgodnie z procedurą opisaną w Podrozdziale 4.1. Odstępy między kolejnymi pomiarami następowały zależnie od potrzeb – wynosiły od 5 do 15 minut. Każdy z pomiarów miał swój indywidualny numer seryjny składający się z litery oznaczającej kolbę oraz liczby porządkowej dla danego momentu pomiarowego (przy czym pomiary dla kolb A, B i C wykonane w tym samym momencie od infekcji w kolbie adsorpcyjnej miały ten sam numer i różniły się tylko literą). W pierwszym podejściu określano: czy czas latencji jest krótszy od 60 minut; w związku z czym wszystkie 12 pomiarów odbywało się tylko dla kolby A i między każdymi dwoma był odstęp czasowy 5 minut. W następnym podejściu wykonywano 19 pomiarów (pomiary A1-A5 wykonywane co 10 minut, a pomiary A5-A19 wykonywane co 5 minut). Po określeniu czasu latencji wykonywano kolejne powtórzenie, tym razem w odstępach 15-minutowych dla pomiarów A1-A6 oraz w odstępach 5-minutowych dla pomiarów A6-A14 i B8-B20. Celem wprowadzenia do doświadczenia kolby B było określenie, czy faza plateau ustala się w obrębie 10-krotnego rozcieńczenia hodowli z zachowaniem policzalności łysinek na szalce (z kolby B), czy dopiero w obrębie 100-krotnego rozcieńczenia hodowli (z kolby C). Po ustaleniu czasu latencji, tj. czasu, po którym nastąpił wysyp nowych cząstek infekcyjnych z zainfekowanych komórek gospodarza, postanowiono, że w następnym podejściu do eksperymentu, na około 10 minut przed przewidywanym wysypem, zbierane będą z kolby B próbki po 100 µl równolegle z dotychczas zbieranymi pomiarami z kolby A – dzięki czemu określano, po jakim czasie kończył się pierwszy wysyp i zachodziła faza drugiego plateau. Czwarte i piąte podejście przewidywały wykorzystanie 3 kolb: kolby A, kolby B i kolby C, dla których wiadomo było zarówno: ile wynosi czas latencji oraz jaki jest czas, w którym dojdzie do drugiego plateau (Rycina 16).
Podczas projektowania wykresu w oparciu o ilość łysinek mnożono ilość tych łysinek przez współczynnik (1000 µl/X)*10Y, gdzie X to objętość nakroplenia (tu 10 µl) lub objętość próbki badanej w teście pełnoszalkowym (tu 100 µl), zaś Y to rząd wielkości rozcieńczenia próbki względem zawartości kolby A. Wykres przedstawiano w formie diagramu punktowego. W późniejszym wariancie procedury odpowiednikiem kolejnych kolb były kolejne 10-krotne rozcieńczenia dla każdej próbki z kolby A.
Przypisy
- ↑ Rolą chloroformu było zabicie wszystkich komórek bakteryjnych w próbce. Skutkowało to wyeliminowaniem centrów infekcyjnych, które pochodzą z bakteriofagów zaadsorbowanych do komórek. Ewentualne łysinki powstałe na szalce z kontrolą mogły pochodzić jedynie z niezaadsorbowanych cząstek infekcyjnych. Ponieważ jednak cząstki fagowe składane w zainfekowanych komórkach są infekcyjne jeszcze zanim nastąpi rozpad komórki, pomiary prób kontrolnych wykonywano tylko dla pierwszych 15 minut eksperymentu.
Dodatkowe informacje o autorach i źródle znajdują się na stronie dyskusji.