Wstępna charakterystyka bakteriofaga Serratia φOS10/Spis treści

SPIS TREŚCI

Strona tytułowa 

 1

Oświadczenie autora i promotora 

 2

Streszczenie 

 3

Spis treści 

 4

Podziękowania 

 7

1. Wstęp 

 8

1.1 Informacje ogólne o wirusach 

 8

1.1.1 Wirusy infekujące bakterie – bakteriofagi 

 11

1.1.2 Klasyfikacja i taksonomia wirusów 

 11

1.2 Budowa wirionów bakteriofagów z rzędu Caudovirales 

 14

1.3 Modularna struktura genomów bakteriofagów 

 16

1.4 Opis cyklu infekcyjnego bakteriofagów z rzędu Caudovirales 

 17

1.5 Cykl lizogenny, stan pseudolizogenii, infekcja chroniczna 

 21

1.5.1 Cykl lizogenny 

 21

1.5.2 Stan pseudolizogenii 

 24

1.5.3 Infekcja chroniczna 

 24

1.5.4 Wpływ sekwencji profagowych na funkcjonowanie gospodarza 

 24

1.6 Analiza bioinformatyczna genomów fagowych 

 26

1.6.1 RAST 

 27

1.6.2 Artemis 

 27

1.6.3 BLAST 

 28

1.6.4 HMMER 

 29

1.6.5 Virfam 

 29

1.6.6. Serial Cloner 

 30

1.6.7. ARAGORN 

 30

1.7 Bakterie rodzaju Serratia i infekujące je bakteriofagi 

 31

1.8 Pochodzenie szczepów psychrofilnych Serratia spp. badanych w tej pracy 

 33

2. Cel 

 35

3. Materiały 

 36

3.1 Próbka badana 

 36

3.2 Szczepy bakteryjne 

 36

3.3 DNA 

 36

3.3.1 Startery do reakcji PCR 

 36

3.3.2 Wykorzystany wektor plazmidowy 

 36

3.3.3 Marker wielkości 

 37

3.4 Podłoża bakteryjne 

 37

3.5 Bufory i roztwory 

 37

3.5.1 Bufory i odczynniki do elektroforezy DNA 

 37

3.5.2 Bufor SM 

 37

3.5.3 Bufory do przygotowywania komórek kompetentnych metodą rubidowo-wapniową 

 38

3.5.4 Bufor STE 

 38

3.6 Enzymy 

 38

3.7 Inne 

 38

3.8 Zestawy 

 39

3.9 Aparatura 

 39

3.10 Oprogramowanie 

 40

4. Metody 

 41

4.1 Określanie miana zawiesiny fagowej metodą nakropleń i metodą testu pełnoszalkowego 

 41

4.2 Izolacja cząstek fagowych 

 41

4.3 Izolacja DNA fagowego 

 42

4.4 Trawienia enzymami restrykcyjnymi 

 42

4.5 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym 

 43

4.6 Reizolacja fragmentów DNA z żelu agarozowego 

 43

4.7 Wypełnianie jednoniciowych końców DNA z użyciem Fragmentu Klenowa 

 43

4.8 Wypełnianie jednoniciowych końców DNA z użyciem Polimerazy faga T4 

 44

4.9 Reakcja ligacji 

 44

4.10 Pomiar gęstości optycznej hodowli płynnej 

 44

4.11 Przygotowanie komórek kompetentnych metodą rubidowo-wapniową 

 44

4.12 Transformacja DNA do bakterii chemokompetentnych 

 45

4.13 Izolacja plazmidowego DNA metodą minilizy alkalicznej 

 45

4.14 Reakcja PCR 

 46

4.15 Przygotowanie matrycy do kolinijnego PCR 

 47

4.16 Sekwencjonowanie 

 48

4.17 Analiza bioinformatyczna 

 48

4.17.1 Identyfikacja otwartych ramek odczytu 

 48

4.17.2 Adnotacja otwartych ramek odczytu 

 48

4.17.3 Przyporządkowanie taksonomiczne bakteriofaga do rodziny 

 49

4.17.4 Wirtualne cięcie genomu bakteriofaga enzymami restrykcyjnymi 

 49

4.17.5 Wyszukiwanie genów kodujących tRNA 

 49

4.18 Badanie kinetyki adsorpcji bakteriofaga 

 50

4.19 Badanie jednego etapu replikacji (One-Step Growth) faga φOS10 

 51

4.19.1 Określenie miana hodowli gospodarza dla OD ₆₀₀ = 0,5 

 51

4.19.2 Określenie wartości MOI i odsetku jednokrotnych infekcji 

 51

4.19.3 Określenie czasu latencji i plonu fagowego 

 53

5. Wyniki i dyskusja 

 56

5.1 Uzyskanie czystych kultur fagowych z próbki środowiskowej metodą szalek dwuwarstwowych i określenie ich morfologii 

 56

5.2 Analiza restrykcyjna izolatów DNA z badanych czystych kultur fagowych 

 57

5.3 Analiza bioinformatyczna 

 58

5.3.1 Analiza genomu bakteriofaga φOS10 

 59

5.3.2 Adnotacja otwartych ramek odczytu w genomie bakteriofaga φOS10 

 67

5.3.3 Określenie przynależności taksonomicznej 

 76

5.4 Określenie sekwencji cos 

 77

5.5 Weryfikacja zdolności do wejścia w stan lizogenii φOS10 

 79

5.6 Badanie kinetyki adsorpcji bakteriofaga φOS10 do gospodarza 

 80

5.7 Badanie jednego etapu replikacji (ang. One-Step Growth) faga φOS10 

 82

5.7.1 Badania pilotażowe 

 82

5.7.2 Badanie czasu latencji i wielkości wyrzutu fagowego 

 83

5.8 Proponowane kierunki dalszych badań 

 89

6. Podsumowanie 

 90

7. Bibliografia 

 91